c2.6.15 – Isolamento ed analisi di espressione di catalasi in Pinus sp.p.

Danti S, Bagnoli F, Racchi ML

Istituto di Selvicoltura, Università degli Studi di Firenze, v. San Bonaventura 13 – 50145 Firenze (FI)
Collocazione: c2.6.15 – Tipo Comunicazione: Poster
2° Congresso SISEF *
Sessione 6: “Posters” *

Abstract: I modelli climatici prevedono che il progressivo aumento dei livelli di CO2 determinerà un innalzamento della temperatura che a sua volta porterà ad un cambiamento nella distribuzione delle precipitazioni con periodi estivi di prolungata siccità nelle regioni temperate. A questo si aggiunge il costante aumento della concentrazione d’azoto atmosferico specialmente nelle aree maggiormente industrializzate. In questo quadro climatico ambientale ci si può attendere che le piante, da una parte possano beneficiare di una aumentata capacità fotosintetica, ma, dall’altra debbano affrontare condizioni di stress idrico ed esposizione all’ozono. A livello cellulare, entrambi gli stress determinano un aumento dello stress ossidativo. Le piante, come tutti gli organismi aerobi hanno sviluppato dei sistemi di difesa contro il danno ossidativo costituiti da enzimi e composti antiossidanti. Insieme alle perossidasi e alle superossido dismutasi, le catalasi costituiscono il principale sistema enzimatico attraverso cui la cellula vegetale è in grado di rimuovere molecole di H2O2. Le catalasi, grazie alla loro specificità spaziale e temporale, rappresentano un sistema modello per lo studio dell’espressione genica sia in condizioni fisiologiche normali che in risposta allo stress. Per questo le catalasi sono state ben caratterizzate dal punto di vista biochimico e molecolare nelle specie erbacee. L’esistenza di diverse isoforme con una differente attività durante lo sviluppo è stato dimostrato anche in specie arboree, quali cipresso e ippocastano. Dato il ruolo fondamentale che questi enzimi presentano nel metabolismo cellulare durante lo sviluppo e nei meccanismi di difesa dagli stress abiotici e biotici, lo scopo della ricerca è l’isolamento e la caratterizzazione molecolare dei geni codificanti le catalasi nelle piante arboree ed in particolare viene qui riportato il lavoro condotto sulle specie mediterranee del genere Pinus. La ricerca è iniziata con l’identificazione delle forme di catalasi mediante PAGE nativa. L’analisi dei pattern elettroforetici di catalasi è stata condotta sugli aghi delle specie P. pinea, P. pinaster e P. radiata in diverse fasi dello sviluppo a partire dalla germinazione fino alla pianta adulta. Il profilo enzimatico è stato ottenuto in P. pinea analizzando gli stadi di sviluppo: vegetativo giovane e vegetativo adulto, cotiledone, materiale micropropagato in vitro. L’analisi degli zimogrammi ha messo in evidenza la presenza di tre isoforme che sono state definite in base alla differente mobilità elettroforetica: CAT-1, CAT-2, CAT-3 rispettivamente con una mobilità veloce, media e lenta. Il profilo elettroforetico specifico del cotiledone e dell’ago in vitro è caratterizzato da una elevata attività di CAT-2 ed una più ridotta di CAT-1. Il pattern di attività degli aghi in vivo presenta la comparsa della isoforma specifica CAT-3. Basandosi sulla classificazione delineata da Willekens, CAT-1 è una catalasi di classe III espressa a livello embrionale, CAT-2 è una catalasi di classe I espressa nei tessuti fotosintetici e CAT-3 è una catalasi di classe II caratteristica dei tessuti lignificati. L’indagine è stata condotta con le stesse modalità anche su pinaster e radiata ottenendo risultati analoghi. L’isolamento e la caratterizzazione dei cDNA codificanti le catalasi sono stati affrontati con due diverse strategie sperimentali: RT-PCR e screening di una libreria di cDNA. Mediante RT-PCR, utilizzando primer disegnati sulla base delle sequenze nucleotidiche altamente conservate tra le diverse specie vegetali, abbiamo iniziato a isolare cDNA parziali da diversi tessuti. Inoltre lo screening della libreria di cDNA, con approcci diversi, consentirà l’isolamento delle sequenze complete. Mediante RT-PCR abbiamo isolato, da aghi giovani e da aghi adulti di P. pinea un cDNA di 890 bp codificante una catalasi di 296 AA. La sequenza nucleotidica parziale presenta il 76% di omologia con la sequenza di M. crystallinum (cat foglia) di cui costituisce il 48% della sequenza completa; lo stesso grado di omologia lo presentano G. max (cat 4) e N. plumbaginifolia (cat 3) invece la sequenza di Z. mais (cat 1) ha un’omologia pari al 74%. L’allineamento aminoacidico con le specie sopra menzionate ha permesso di stabilire che la sequenza isolata può essere attribuita al gruppo I della classificazione fatta da Guan e Scandalios. Questo indicherebbe che la sequenza da noi isolata codifica per la forma enzimatica filogeneticamente più antica. Utilizzando come sonda il frammento cDNA di 890 bp abbiamo iniziato l’analisi per Northern della catalasi da noi isolata. Sono stati considerati diversi tessuti ed in particolare: il cotiledone e gli aghi provenienti da piante di età diversa. Sono stati analizzati aghi da semenzali, piante giovani ed adulte e da materiale propagato in vitro. La presenza di un trascritto di 1.8 Kb è stata rilevata in tutti i vari tessuti analizzati. Un addizionale trascritto di grandi dimensioni (4.7 Kb) è stato invece inaspettatamente trovato in tutti i campioni in esame con l’eccezione del materiale propagato in vitro. Questo trascritto rappresenta, presumibilmente, la forma non processata del RNA della catalasi in esame. Questo dato, confermato per questo gene anche da risultati ottenuti su pesco, sembrerebbe indicare una regolazione post-trascrizionale per il gene di catalasi. Una ulteriore caratterizzazione molecolare del gene è tuttora in corso.

Citazione: Danti S, Bagnoli F, Racchi ML (1999). Isolamento ed analisi di espressione di catalasi in Pinus sp.p. . 2° Congresso Nazionale SISEF, Bologna, 20 – 22 Ott 1999, Contributo no. #c2.6.15